小飞飞
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cGAS(cyclicGMP-AMPsynthase)–STING(stimulatorofinterferongenes)通路在机体中能感受细胞中异常存在的DNA，进而激活I型干扰素产生，对机体抗病*免疫，抗肿瘤免疫以及一些自身免疫病的发生都有重要作用。cGAS识别双链DNA(dsDNA)后活化，催化腺嘌呤三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）和鸟嘌呤三磷酸（guanosinetriphosphate，GTP）产生2‘3’-环鸟嘌呤一磷酸-腺嘌呤一磷酸（cyclicguanosinemonophosphate–adenosinemonophosphate，cGAMP)，cGAMP作为第二信使特异性结合内质网上STING，激活STING招募激活下游信号分子，诱导I型干扰素的表达启动干扰素免疫反应。
药理学上激活STING，被认为是治疗肿瘤的有效策略之一。cGAMP的类似物，环二核苷酸（cyclicdinucleotides，CDNs）作为STING的激活剂，便引起人们极大兴趣的。但是cGAMP类似物的合成是领域内极大的挑战和阻碍，一方面是由于CDNs的结构和其功能的关系以及其分子极性，另一方面cGAMP和其类似物是由两个不同核苷酸组成的异源二聚体，合成过程中在保证选择性形成不对称的2’5’和3’5’连接的同时需要避免形成同源环化。cGAMP的硫代磷酸类似物，在磷原子上添加了两个额外的手性中心，其构象和结构需要在激活以及环化合成过程中更加精准地进行控制。通常合成特定非对映异构体的硫代磷酸，需要多步的保护基团操纵以及特殊的纯化步骤。最近，基于P(V)手性辅助配体以及P(III)的化学合成对于解决手性选择合成有了一定的进步改进。但是，该过程依旧需要特殊的试剂，保护基团，过多的合成步骤以及色谱分离。
年3月16日，来自美国默克公司MerckCo.,Inc.的JohnA.McIntosh，ZhijianLiu和BrianM.Andresen的研究团队在Nature上发表题为Akinase-cGAScascadetosynthesizeatherapeuticSTINGactivator的文章，研究团队发现了一种STING的新型高效激动剂MK-（已应用于肿瘤免疫治疗的临床试验中(ClinicalTrials.govstudyNCT）)，并通过筛选以及定向进化cGAS和多种不同激酶，构建了从单磷酸核苷酸到环二核苷酸MK-级联生物合成途径，可合成产生克级别的MK-。证明了利用生物合成途径发现制造复杂非自然分子的巨大潜能。
研究团队根据体内细胞中cGAS能够高效环化ATP和GTP的到启发，研究体外人cGAS能否环化非自然的三磷酸核苷酸（non-naturalnucleotidetriphosphates，NTPs）。的确，野生型的人cGAS环化不同的NTPs产生多种新的CDNs。随后通过基于P(III)的化学合成，合成了硫代磷酸的CDNs，和原本的磷酸CDNs母体相比硫代磷酸CDNs展现出更好的生物活性。分析磷酸基团中璘的立体化学结构与活性的关系，Rp/Rp硫代磷酸的非对应异构体活性最好，基于此研究团队发现了MK-，MK-和cGAMP以及cGAMP的硫代磷酸类似物相比都具有更好的活性（图1）。MK-和STING配体结合域的晶体结构显示，MK-和其他CDNs类似可以诱导STING发生一个闭合激活态构象，结构数据也确认了Rp/Rp立体化学构象以及分子和STINGArg的相互作用都对活性具有重要影响。
图1MK-的发现
尽管P(III)化学能产生一定量的硫代CDNs应用于临床前评价，但这种途径合成MK-需要九个步骤，涉及到不稳定的中间媒介以及多种保护基团的操纵，最后也需要色谱分离想要的Rp/Rp异构体，产量极低。因此需要重新设计MK-的合成此策略以一种经济现实的方式商业化生产出MK-。考虑到cGAS生物催化在MK-发现过程中的作用，研究团队设想工程化筛选设计一种cGAS酶，使其能够接受环化相应的硫代核苷酸，并产生单一一种目标立体构象的硫代CDNs，同时这一策略还需要设计相应硫代三磷酸核苷酸的生物合成方法。
接下来研究团队寻找能选择性催化硫代三磷酸核苷酸形成Rp/Rp硫代磷酸构象CDNs的cGAS。发现人cGAS并不能很好实现这一功能。通过筛选大量其他动物的cGAS发现，来源于秃鹰(Haliaeetusleucocephalus,baldeagle)的cGAS能在Co2+的催化下将2′F-(Sp)-thioATP和3′F-(Sp)-thioGTP环化产生所需的MK-（图2）。随后通过多轮的cGAS定向进化，进一步提高了cGAS了的活性并确立了Zn2+/Co2+双金属催化体系。
图2cGAS催化合成MK-
随后团队寻找两种硫代三磷酸核苷酸底物2′F-(Sp)-thioATP和3′F-(Sp)-thioGTP的生物合成策略，通过筛选研究团队发现来自Saccharomycescerevisiae的腺苷酸激酶（adenylatekinase,AK）和Branchistomafloridae的鸟苷酸激酶（guanylatekinase,GK）能够将相应的硫代一磷酸核苷酸在ATP作为高能磷酸供体的情况下产生相应的特定立体构象的硫代二磷酸核苷酸，随后在乙酰磷酸作为磷酸供体在Thermotogamaritima来源的乙酸激酶（acetatekinase，AcK）的催化下，产生相应的硫代三磷酸核苷酸。随后通过对三个激酶的定向进化，进一步优化，使得AK和GK都可以以少量的2′F-(Sp)-thioATP（产物之一）作为第一步反应的磷酸供体起始反应，以避免利用ATP对下游环化反应的影响（图3）。
图3激酶合成硫代三磷酸核苷酸
进一步优化条件，研究团队将硫代三磷酸合成和cGAS环化步骤进行整合，实现了从硫代一磷酸核苷酸到MK-的合成。且最后可以高产率产生出克级别的单一立体构象的MK-活性分子。
图4MK-的级联合成途径
总之，本研究在不使用保护基团和手性辅助配体的情况下，通过平衡酶的选择性，实现在一个单一反应流程种，利用四种不同的酶形成六种键，来合成单一特定立体构象的CDNMK。本研究不仅强调了可以利用酶化学，酶的定向进化解决复杂分子和药物的合成问题，同时也表明了非自然生物合成和生物催化的巨大潜能。
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